Elettroforesi su gel di agarosio
L'elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separare acidi nucleici. Questa tecnica sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente) per farle migrare, in un campo elettrico, attraverso un gel di agarosio. Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, i quali consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi quindi si avrà una separazione in funzione della velocità.
Il DNA, carico (–) a pH neutro, migra verso il polo positivo (anodo)
Il DNA, carico (–) a pH neutro, migra verso il polo positivo (anodo)
Fattori che influenzano l'elettroforesi su gel di agarosio
Con K=cotante che varia al variare della concentrazione di agarosio nel gel. Vi è una relazione tra pb e PM: le molecole grandi migrano lentamente, le molecole piccole migrano velocemente;
- superavvolto: corre più velocemente perché più compatto;
- circolare: corre più lentamente perché, essendo meno compatto, fa fatica a muoversi tra i pori del gel;
- lineare: via di mezzo tra DNA superavvolto e DNA circolare;
- dimensioni del DNA
Con K=cotante che varia al variare della concentrazione di agarosio nel gel. Vi è una relazione tra pb e PM: le molecole grandi migrano lentamente, le molecole piccole migrano velocemente;
- concentrazione di agarosio (D-Galattoso-3, 6-Anidro-L-Galattoso) nel gel
- conformazione del DNA
- superavvolto: corre più velocemente perché più compatto;
- circolare: corre più lentamente perché, essendo meno compatto, fa fatica a muoversi tra i pori del gel;
- lineare: via di mezzo tra DNA superavvolto e DNA circolare;
- voltaggio applicato
- presenza di bromuro di etidio
- composizione (forza ionica) del buffer
Caricamento dei campioni
I campioni da analizzare vanno depositati, con una micropipetta, in apposite fenditure verticali, dette "pozzetti", praticate nel gel a poca distanza dal margine dalla parte del polo negativo. Essendo il DNA un polianione i frammenti migreranno in avanti verso il polo positivo. All'atto del caricamento, al campione viene solitamente aggiunta una "soluzione di caricamento", colorata generalmente con blu di bromofenolo e xilene cianolo, contenente glicerolo per agevolare la precipitazione del campione sul fondo del pozzetto.
I campioni da analizzare vanno depositati, con una micropipetta, in apposite fenditure verticali, dette "pozzetti", praticate nel gel a poca distanza dal margine dalla parte del polo negativo. Essendo il DNA un polianione i frammenti migreranno in avanti verso il polo positivo. All'atto del caricamento, al campione viene solitamente aggiunta una "soluzione di caricamento", colorata generalmente con blu di bromofenolo e xilene cianolo, contenente glicerolo per agevolare la precipitazione del campione sul fondo del pozzetto.