Elettroforesi bidimensionale
L'elettroforesi bidimensionale o elettroforesi 2D è un tipo di tecnica elettroforetica utilizzata nel campo della proteomica per separare miscele proteiche complesse (formate cioè da più specie proteiche differenti), come ad esempio una miscela di proteine estratta da una cellula in un dato momento del ciclo cellulare.
La tecnica consta di due dimensioni ortogonali lungo le quali sono separate le diverse proteine. In proteomica, il termine ortogonale indica in genere due dimensioni lungo le quali la separazione avviene sfruttando principi fisici differenti, che non sono influenzati l'uno dall'altro. Nel caso dell'elettroforesi bidimensionale, i principi più utilizzati sono il punto isoelettrico (valore di pH al quale una molecola non reca alcuna carica elettrica netta)e il peso molecolare.
La prima dimensione utilizza solitamente un gradiente di pH ottenuto grazie a molecole anfotere che sono fatte migrare all'interno di un supporto, costituito in genere da un gel di poliacrilammide, posto in un campo elettrico. Negli ultimi anni si sono diffuse nei laboratori strisce (strip) prefabbricate, in cui sono immobilizzati degli anfoliti; durante la polimerizzazione, il gel costituente le strip, è sottoposto a un campo elettrico esterno in modo che si venga a generare il gradiente di pH. Questo sistema basato sulle strip garantisce una maggiore stabilita' del gradiente ed un'elevata riproducibilità sperimentale. Il campione viene caricato sul gel; il campo elettrico applicato fa sì che le proteine, presenti in forma ione, si muovano fino a raggiungere il proprio punto isoelettrico, al quale, ogni molecola si trova sotto forma di zwitterione (molecola elettricamente neutra nel suo complesso che però presenta sia cariche positive sia negative localizzate a carica complessiva pari a zero). Il processo descritto prende il nome di isoelettrofocalizzazione (IEF o isoelectrofocusing)
Durante la seconda dimensione il campione viene trattato con SDS (sodio dodecilsolfato) per conferire a tutte le proteine una carica elettrica netta negativa. Segue quindi una classica SDS-PAGE in cui le specie proteiche si dividono in funzione del loro peso molecolare. Le proteine sono infine evidenziate mediante colorazione, utilizzando ad esempio il blu di Coomassie o il nitrato d'argento.
La tecnica consta di due dimensioni ortogonali lungo le quali sono separate le diverse proteine. In proteomica, il termine ortogonale indica in genere due dimensioni lungo le quali la separazione avviene sfruttando principi fisici differenti, che non sono influenzati l'uno dall'altro. Nel caso dell'elettroforesi bidimensionale, i principi più utilizzati sono il punto isoelettrico (valore di pH al quale una molecola non reca alcuna carica elettrica netta)e il peso molecolare.
La prima dimensione utilizza solitamente un gradiente di pH ottenuto grazie a molecole anfotere che sono fatte migrare all'interno di un supporto, costituito in genere da un gel di poliacrilammide, posto in un campo elettrico. Negli ultimi anni si sono diffuse nei laboratori strisce (strip) prefabbricate, in cui sono immobilizzati degli anfoliti; durante la polimerizzazione, il gel costituente le strip, è sottoposto a un campo elettrico esterno in modo che si venga a generare il gradiente di pH. Questo sistema basato sulle strip garantisce una maggiore stabilita' del gradiente ed un'elevata riproducibilità sperimentale. Il campione viene caricato sul gel; il campo elettrico applicato fa sì che le proteine, presenti in forma ione, si muovano fino a raggiungere il proprio punto isoelettrico, al quale, ogni molecola si trova sotto forma di zwitterione (molecola elettricamente neutra nel suo complesso che però presenta sia cariche positive sia negative localizzate a carica complessiva pari a zero). Il processo descritto prende il nome di isoelettrofocalizzazione (IEF o isoelectrofocusing)
Durante la seconda dimensione il campione viene trattato con SDS (sodio dodecilsolfato) per conferire a tutte le proteine una carica elettrica netta negativa. Segue quindi una classica SDS-PAGE in cui le specie proteiche si dividono in funzione del loro peso molecolare. Le proteine sono infine evidenziate mediante colorazione, utilizzando ad esempio il blu di Coomassie o il nitrato d'argento.